By Marta Koblańska, as a translator, the translation based on ,,Nature” published research, January 2021, edited April 30, 2026, photo: AI-generated neural structure, Pixabay

Zakażenie wirusem Zika (ZIKV) kobiety w ciąży może skutkować samoistną utratą ciąży, koniecznością aborcji, urodzeniem martwego dziecka, zgonem dziecka po narodzinach albo wadami wrodzonymi, głównie mikrocefalią (małogłowiem) u dziecka. Ta ostatnia jest wadą wrodzoną. 

Praca opublikowana w „Nature” w 2020/21 roku i przetłumaczona przez autorkę tekstu do 10 stycznia 2021 roku miała na celu zbadanie in situ (miejscowo) profilu odpowiedzi immunologicznej i mechanizmów uszkodzenia komórek neuronalnych/glejowych (neuronów oraz astrocytów pełniących określone i odrębne funkcje w mózgu, choć ich „działanie” w przypadku prawidłowej pracy jest ze sobą skorelowane – przyp. MK) w przypadkach mikrocefalii zakończonych zgonem. Próbki tkanki mózgowej zostały pobrane od 15 zmarłych noworodków. Próbki tkanki pobierano od 10 noworodków z mikrocefalią z pozytywnym wynikiem na obecność wirusa oraz od 5 noworodków pod kontrolą neonatologiczną z wynikiem negatywnym na obecność wirusa zmarłych z innych przyczyn. Struktura ośrodkowego układu nerwowego CNS została zachowana. W przypadkach mikrocefalii, czynniki histopatologiczne pochodzące z próbek tkankowych zostały scharakteryzowane w trzech obszarach/przedziałach ośrodkowego układu nerwowego CNS (opon mózgowo-rdzeniowych, przestrzeni okołonaczyniowej oraz miąższu). Odkryte zmiany to głównie zwapnienia, martwica, neuronofagia, glejoza, guzki mikrogleju oraz naciek zapalny komórek jednojądrzastych.

Miejscowa odpowiedź immunologiczna przeciw Zika w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS) nowonarodzonych jest złożona. Pomimo przeważającej ekspresji cytokin (czynników prozapalnych) Th2, inne cytokiny takie jak Th1, Th17, Treg, Th9 oraz Th22 są zaangażowane w proces degradacji komórkowej. W mniejszym stopniu, ale nadal mogą uczestniczyć w immunopatogennych mechanizmach choroby neuronów w przypadkach mikrocefalii spowodowanej przez ZIKV zakończonych zgonem. Mikrocefalia to w dużym uproszczeniu proces zmniejszania właściwej masy komórkowej mózgowia przy jednoczesnym zwiększaniu proporcji uwodnienia – przyp. MK. 

Wprowadzenie

Wirus Zika (ZIKV, rodzaj Flavivirus, rodzina Flaviviridae) został wyizolowany w 1947 roku z Macaca mulatta w Lesie Zika w Ugandzie i podobnie do innych flawiwirusów może powodować uszkodzenia płuc, nerek, wątroby i mózgu.

W kontekście trudności prezentacyjnych, wiele badań obecnie próbuje scharakteryzować związek zakażenia ZIKV z zespołem Guillaina-Barrégo oraz mikrocefalią, jak również mechanizmy leżące u podstaw przekazywania wirusa drogą seksualną oraz wertykalną. Jednakże na poziomie CNS nadal istnieje wiele luk we współczesnym zrozumieniu mechanizmów przyczyniających się do mikrocefalii wywołanej zakażeniem wirusem ZIKA. Opisywane badanie w istotnym stopniu wyjaśnia owe zawiłości. 

Niektóre badania już wcześniej udowodniły, że leżąca u podstaw stopniowej śmierci neuronów infekcja jest bezpośrednio związana z mikrocefalią, szczególnie z powodu produkcji dużej ilości białka caspage 3 w neuronach kory mózgowej. Jednakże z całym szacunkiem dla odpowiedzi immunologicznej, która zachodzi w mózgu noworodków z mikrocefalią, nie było wcześniej badań, które wykorzystałyby to podejście do problemu. W szczególności brakuje badań przyglądających się miejscowej odpowiedzi immunologicznej w tkance mikrośrodowiska. Ta odpowiedź immunologiczna jest ważna w kontekście zrozumienia immunopatogenezy obrażeń, jako że jest blisko związana z mechanizmami uszkodzenia tkanki wywoływanymi przez sam układ immunologiczny.

Ponieważ ośrodkowy układ nerwowy CNS jest „uprzywilejowany” immunologicznie w kontekście głębokiej wybiórczości bariery krew-mózg pod względem kinetyki komórek i przepływu cytokin między krwią a tkanką, zbadanie miejscowego profilu odpowiedzi oraz mechanizmu uszkodzenia komórek neuronalnych jest istotne do zrozumienia patogenezy mikrocefalii powodowanej przez ZIKV. Dlatego też, poprzez rozpoznanie, że ten związek może rzucić nowe światło na immunopatogenezę schorzenia, praca naukowców opisuje badania lokalnego profilu odpowiedzi immunologicznej oraz mechanizmu uszkodzenia komórki neuronu u martwourodzonego noworodka oraz noworodków zainfekowanych ZIKV, które zmarły po urodzeniu.

Wyniki

Badanie było prowadzone na próbkach tkanki mózgowej pobranych od 10 przypadków mikrocefalii. Próbki pobrano od 8 noworodków (dwie dziewczynki i sześciu chłopców) z czasem przeżycia od 2 godzin do 27 dni (mediana jeden dzień) oraz dwojga martwo urodzonych noworodków (dziewczynka i chłopiec). Pięcioro pacjentów (cztery dziewczynki i jeden chłopiec) wykorzystano do kontroli próbek w badaniu.

Opis głównych odchyleń histopatologicznych odkrytych u nowowrodków z mikrocefalią spowodowaną wirusem Zika

Czynniki histopatologiczne próbek tkanki zostały scharakteryzowane przez zmiany oponowe, okołonaczyniowe oraz miąższowe. Przekrwienie naczyń i nacieki zapalne, składające się głównie z limfocytów i makrofagów, były obserwowane w oponach, przypominając wirusowe zapalenie opon mózgowych. Środowisko okołonaczyniowe wykazywało przekrwienie z różnym nasileniem, a naciek zapalny komórek jednojądrzastych nachodził na obszar Virchow-Robina. Analiza środowiska śródmiąższowego wykazała odchylenia o różnym nasileniu, w tym glejozę, zwapnienia, neuronofagię, martwicę, guzki mikrogleju, wakuolizację oraz zanik neuronów.

Ocena immunohistochemiczna

Zaobserwowanie koloru brązowego we fragmentach tkanki zostało zdefiniowane jako faktyczne barwienie immunologiczne do oceny różnych procesów, w tym mechanizmów uszkodzenia tkanki oraz odpowiedzi układu odpornościowego gospodarza w tkance uszkodzonej infekcją ZIKV.

Barwienie immunologiczne białka caspase 3 w trzech analizowanych przedziałach (opon mózgowo-rdzeniowych, przestrzeni okołonaczyniowej oraz miąższu) istotnie się różniło w porównaniu z grupą kontrolną. Zwyżka ekspresji białka caspase 3 była szczególnie oznaczana w miąższu, zwłaszcza w przypadkach uszkodzenia komórek neuronalnych w korze mózgowej, w których głębokie barwienie było obserwowane w neuronach zwakualizowanych (o dużym nasyceniu wodą – przyp. MK) oraz apoptotycznych, czyli takich, w których zachodził proces programowanej śmierci komórki.

Charakterystyka nacieku komórki

Opis fenotypu miejscowego nacieku zapalnego ujawnił obecność komórek z antygenem i astrocytów (S100), komórek (CD57) naturalnie niszczących potencjał prozapalny w postaci komórek (NK), M1 makrofagów/mikrogleju (CD68), M2 makrofagów/mikrogleju (CD163), limfocytów T (CD8+, CD4+) oraz komórek regulacyjnych T (Treg) (FoxP3).

Komórki z antygenem S100 zostały zaobserwowane w trzech analizowanych przedziałach. Odkryto znaczące różnice w porównaniu z grupą kontrolną. W przypadkach, w których obserwowano pogrubienie opon mózgowo-rdzeniowych oraz oznaczone unaczynienie, barwienie immunologiczne S100 było związane z obecnością antygenu znajdującego się w komórce. Takie ,,zmodyfikowane” komórki były odnajdywane w miąższu oraz przestrzeni okołonaczyniowej, jak również w obszarach kory mózgowej charakteryzujących się ubytkiem neuronów. W miąższu nerwowym głębokie immunobarwienie zaobserwowano w astrocytach gemistrocytarnych. (Astrocyty to komórki mózgowe – upraszczając- odpowiedzialne w toku przekształceń i wzrostu za funkcje motoryczne, czyli zdolność do poruszania, ale mogą mieć również udział w transmisji sygnałów słuchowych oraz generowaniu mowy – przyp. MK). 

W trzech omawianych przedziałach, liczba komórek CD57 + NK (komórki prozapalne) była większa w jednojądrzastym nacieku zapalnym. Różnice były obserwowane w średniej liczbie komórek CD68 i CD163 – pozytywnych, które charakteryzują się odpowiednio obecnością M1 i M2 makrofagów/mikrogleju. Nie zanotowano istotnej różnicy w ekspresji CD68 w porównaniu z grupą kontrolną. Dla kontrastu, ekspresja CD163 była wyższa w przypadkach objawów stanu zapalnego opon i mózgu, czemu towarzyszyła silna proliferacja naczyniowa (rozrastanie się naczyń) oraz ogniskowa martwica w warstwie korowej.

Półilościowa analiza subpopulacji limfocytów T (CD8, CD4) oraz komórek Treg (FoxP3) uwidoczniła zwiększoną ekspresję tych markerów w trzech przedziałach, zwłaszcza w obszarach wykazujących gęsty jednojądrzasty naciek.

Profil cytokinowy i czynniki zaangażowane w odpowiedzi na stan zapalny

Analiza profilu cytokinowego i czynników zapalnych w próbkach wykazała ekspresję cytokin: interferonów IFN-γ, IFN-α, IFN-β, interleukiny IL-6, IL-12A, IL-1β oraz czynnika martwicy nowotworów TNF-α; interleukiny IL-4, IL-10, IL-33, IL-37 oraz transformującego czynnika wzrostu beta 1 TGF-β1; interleukiny IL-9, IL-17, IL-23 oraz IL-22, jak również enzymów iNOS i arginazy 1 (enzymu z grupy hydrolaz). Istniała dominacja markerów Th2, którym towarzyszyły cytokiny prozapalne, iNOS, i arginaza 1. Wykazywały one zwiększoną ekspresję w wyszczególnionych trzech przedziałach w porównaniu z grupą kontrolną. W oponach mózgowo-rdzeniowych ekspresja komórkowa była znacząca w jednojądrzastym nacieku zapalnym, a przestrzeń okołonaczyniowa uwidoczniła podobny wzór immunobarwienia. Immunoekspresja iNOS, arginazy 1 i cytokin, szczególnie interleukinów IL-4, IL-10, IL-12A, IL-23 oraz IL-33, była bardziej intensywna w miąższu mózgu. Ekspresja była obserwowana w jednojądrzastym nacieku zapalnym, w obszarach zwakuolizowanych neuronów, w obszarach martwicy oraz w komórkach apoptotycznych.

Wirus Zika jest czynnikiem zakaźnym, który wywoływał wiele razy niepokój na świecie i tzw. outbreaks (ogniska zapalne/epidemiczne – przyp. MK)  z powodu infekcji/zakażeń mogących spowodować śmierć płodu oraz powikłania u noworodków, w tym mikrocefalię. Rezultaty uzyskane w opisywanej pracy polegające na badaniu martwo urodzonych dzieci oraz noworodków, których zgon został spowodowany ZIKV, uwidoczniły rzeczywisty i złożony związek między odpowiedzią immunologiczną a występowaniem procesu niszczenia komórki. W tym badaniu głównymi rodzajami śmierci komórki były martwica i apoptoza. Jak piszą badacze, zaobserwowali oni, że immunoekspresja interleukin IL-4, IL-10, IL-33, enzymów iNOS, oraz arginazy 1 była zwiększona w przypadkach, w których neuronalna martwica w warstwie korowej okazywała się bardzo głęboka. Pośród tych markerów interleukina IL-33 może być kluczowym czynnikiem niezbędnym do dalszego objaśnienia genezy neuronalnej martwicy, jako że ta cytokina bezpośrednio uczestniczy w procesie nekroptozy będącej rodzajem zaprogramowanej śmierci komórki. (Paradoksalnie duże uwodnienie komórek mózgowia przyspiesza procesy martwicze z uwagi na obecność wirusa – przyp. MK). 

Apoptoza jest prawdopodobnie kluczowym typem śmierci komórki zaangażowanym w wywołanie uszkodzenia CNS spowodowanego ZIKV. W obecnym badaniu ekspresja białka caspase 3 była zwiększona, szczególnie w miąższu obejmującym obszary kory mózgowej. Te odkrycia współistnieją z wynikami modeli eksperymentalnych in vitro oraz sugerują apoptozę jako główny czynnik śmierci komórki neuronalnej i zmniejszonej masy mózgowej u ludzi. Dodatkowo zwiększona ekspresja caspase 3, zwłaszcza w miąższu, korelowała pozytywnie z ekspresją zestawu cytokin, które bezpośrednio lub pośrednio są związane ze zjawiskiem procesu programowanej śmierci komórki.

Fenotyp komórek wywołujących odpowiedź immunologiczną przeciw ZIKV w trzech opisywanych przedziałach składał się z antygenu obecnego w komórce i astrocytów (S100), komórek NK CD57), M1 makrogagów/mikrogleju (CD68), M2 makrofagów/mikrogleju (CD163), limfocytów T (CD4+, CD8+) oraz komórek Treg (FoxP3). Immunobarwienie dla S100 w oponach mózgowo-rdzeniowych i przestrzeni okołonaczyniowej wskazywało, że astrocyty okołonaczyniowe oraz komórki z antygenem mogą aktywnie uczestniczyć w odpowiedzi neurozapalnej. Kilka badań nad flawiwirusami zaraportowało bezpośredni związek komórek z antygenem z wywołaniem neurodestrukcyjnego procesu z powodu neurozapalenia. W modelu eksperymentalnym odnotowano, że ZIKV infekuje ogromną liczbę astrocytów obecnych w warstwach korowych oraz subkorowych.

Interesującym odkryciem jest to, że zakażenie astrocytów było blisko związane ze zwiększoną ekspresją genu AXL. Innym aspektem, który został poddany dyskusji w kontekście wydłużonej infekcji astrocytów (zakażenia wirusem, czyli wiązaniami między białkami struktur mózgowia a wirusowymi – przyp. MK), jest to, że odporność ZIKV (silna budowa genetyczna – przyp. MK) może prowadzić do zwiększonej obecności wirusa w warstwie korowej i zakażenia dodatkowych komórek kory mózgowej (zwiększonej ilości wirusa w mózgu, gdyż proces namnażania trwa – przyp. MK). Co więcej, badania udowodniły, że utrata astrocytów w korze mózgowej może wywołać powstanie procesu zapalnego, uogólnioną śmierć komórki oraz zmniejszenie gęstości gleju i populacji neuronów. To zaś ostatecznie skutkuje powstaniem zwapnień, które są powszechnie odkrywane w przypadkach wrodzonych zakażeń i mikrocefalii z powodu ZIKV.

Autorka powyższego tłumaczenia dziękuje badaczom oraz redakcjom pisma i serwisu online „Nature” za możliwość przetłumaczenia badania na język polski.  Jednocześnie zastrzega, aby w razie potrzeby uzyskania dodatkowych wyjaśnień lub informacji zwracać się bezpośrednio do lekarzy zajmujących się leczeniem mikrocefalii (jest to możliwe) albo naukowców.